缺血性神經(jīng)細(xì)胞損傷有神經(jīng)元壞死和凋亡兩種方式。神經(jīng)元一旦死亡就不可再生，這是腦缺血患者致殘的根本原因。在胚胎、成年動物甚至人腦中可分離出一種未分化的原始細(xì)胞，因其具有自我更新能力和多潛能分化能力，稱之為神經(jīng)干細(xì)胞[1]，其為修復(fù)缺血性腦卒中后遺癥提供了理論基礎(chǔ)。2005～2006年，我們研究了神經(jīng)干細(xì)胞移植對缺血性腦卒中大鼠模型(tMCAO)后遺癥的修復(fù)作用，并確定移植的最佳時機(jī)。
1 材料與方法
1．1 實驗動物 實驗動物(Wistar大鼠)由山東大學(xué)動物實驗中．心提供。取Wistar雄性大鼠(體質(zhì)量28O～32'0 g)制備tMCA0。干細(xì)胞培養(yǎng)取自Wista孕鼠(孕14 d)胎鼠腦。
1．2 主要實驗器材 試劑超凈工作臺、COz恒溫培養(yǎng)箱、熒光顯微鏡、KOPF鼠立體定向儀、全自動微量注射器(UMP22型)和冰凍切片機(jī)等。DMEM／F12，B27，堿性成纖維生長因子(bFGF)，表皮生長因子(EGF)，抗巢蛋白(nestin)單抗，抗5一溴脫氧尿核苷(BrdU)單抗。BrdU一抗為鼠抗BrdU 抗體，二抗為羊抗鼠IgG—CY3，抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)多抗，抗微管蛋白一2(MAP一2)單抗。
1．3 神經(jīng)干細(xì)胞的制備取孕14 d Wistar大鼠的胚胎，分離出海馬組織，機(jī)械消化至呈單細(xì)胞懸液，按Vescoi方法制備[2]。經(jīng)機(jī)械消化后連續(xù)傳代(6次)。
1．4 tMCAO的建立與分組 按Hayashi等的方法建立tMCAO。右大腦中動脈阻斷時間為2 h。tMCAO建立后3d，對所有動物進(jìn)行神經(jīng)損害程度評分(NSS)：10～14分為重度損傷，5～9分中度損傷，1～4分為輕度損傷。評分后分成移植對照組(A組，移植與神經(jīng)干細(xì)胞懸液同等量的PBS)、超早期治療組(B組，術(shù)后1 d移植神經(jīng)干細(xì)胞)、早期治療組(C組，術(shù)后3 d移植神經(jīng)干細(xì)胞)和晚期治療組(D組，術(shù)后7 d移植神經(jīng)干細(xì)胞)。每組10只。
1．5 神經(jīng)干細(xì)胞移植分別在tMCAO制備后的第2、4、8天進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞移植。移植前神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)BrdU(10 t~mol／I )標(biāo)記，再將其溶解于PBS中，干細(xì)胞計數(shù)后將其濃度調(diào)整至2 x 1O 7／1OO ul，移植量為10u1。將大鼠麻醉、固定于立體定向儀，經(jīng)微量注射泵進(jìn)行腦內(nèi)注射移植。移植速度為2ul／min。移植部位為右側(cè)紋狀體缺血半暗區(qū)，即參照鼠腦立體定向圖譜：前囟后0．5 mm、前囟右側(cè)3．5 mm，進(jìn)針深度0．5 mm。注射完畢后留針10 rain，以防止液體反流。
1．6 神經(jīng)功能改善評價與統(tǒng)計學(xué)方法 分別于移植后0．5、1、2、4、6、7、8周對雄性大鼠進(jìn)行NSS評分。應(yīng)用Windows SPSS 1 1．5軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。P≤ 0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
1．7 組織免疫熒光鑒定 于第8周NSS評分后麻醉，經(jīng)4 多聚甲醛灌注并固定取腦。于移植點附近做層厚10 bLm 的冰凍切片，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作。用Leica激光共聚焦掃描顯微鏡觀察免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果。應(yīng)用BrdU單抗免疫組化法檢測培養(yǎng)細(xì)胞的增殖情況。GFAP染色陽性的星形細(xì)胞是由外源性神經(jīng)干細(xì)胞分化而成。
2 結(jié)果
2．1 神經(jīng)干細(xì)胞及其分化能力的鑒定 本實驗在神經(jīng)干細(xì)胞分化前后進(jìn)行nestin抗原抗體實驗，以證明分離的細(xì)胞群是神經(jīng)干細(xì)胞。大鼠神經(jīng)干細(xì)胞體外培養(yǎng)顯示其良好的自我繁殖能力和多向分化能力。體外誘導(dǎo)分化可分化為神經(jīng)干細(xì)胞。分化的神經(jīng)干細(xì)胞呈網(wǎng)狀相互交錯。
2．2 各組tMCAO的評價動物出現(xiàn)前肢屈曲、向手術(shù)對側(cè)推動時傾倒、提尾旋轉(zhuǎn)、行動不協(xié)調(diào)、偏癱、不能站立和行走、痙攣、昏迷等表現(xiàn)則表示模型制作成功。本實驗建立的tMCAO均符合上述要求，NSS評分為(6．8±1．7)分。
2．3 治療后各組NSS評分與免疫學(xué)評價NSS評分見表1。大鼠腦切片免疫組化染色可見大量BrdU染色陽性的細(xì)胞散布在腦內(nèi)，證明是移植的外源性神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞株。該細(xì)胞群中還可見大量GFAP染色陽性的星形細(xì)胞，這是由外源性神經(jīng)干細(xì)胞分化而成。
3 討論
3．1 細(xì)胞移植治療腦卒中的機(jī)制和途徑無論是將細(xì)胞移植到腦卒中損傷同側(cè)還是對側(cè)半球，細(xì)胞都并不是僅僅存在于注射位點或注射側(cè)半球，而是分布于病灶側(cè)和健側(cè)半球。這說明細(xì)胞不止接受腦卒中直接損傷所產(chǎn)生的信號的指引，還接受健側(cè)半球神經(jīng)支配和重組。因此，其神經(jīng)修復(fù)的機(jī)制可能包括：① 移植的細(xì)胞遷移到損傷側(cè)，重建局部環(huán)路，這些環(huán)路足夠保持某些功能；② 移植細(xì)胞擴(kuò)大健側(cè)半球的自發(fā)重組，行使或彌補(bǔ)損傷側(cè)半球喪失的某些功能。在早期階段，神經(jīng)功能改善可能主要是由于移植的細(xì)胞產(chǎn)生的營養(yǎng)因子在發(fā)揮作用；而在晚期階段，神經(jīng)功能改善可能主要是由于移植的細(xì)胞替代變性的宿主細(xì)胞發(fā)揮作用。骨髓基質(zhì)細(xì)胞可能主要是由于其分泌的神經(jīng)營養(yǎng)因子和細(xì)胞外基質(zhì)的作用；而神經(jīng)干細(xì)胞可能是以替代損傷神經(jīng)元、重建環(huán)路為主。
3．2 神經(jīng)干細(xì)胞移植時間 急性腦梗死，由于存在嚴(yán)重的動脈阻塞，缺少血液供應(yīng)，會影響移植物的存活。L i等研究發(fā)現(xiàn)局灶性腦梗死后，缺血半暗區(qū)的細(xì)胞凋亡持續(xù)存在4周。這說明缺血性損傷是一個進(jìn)展的過程。在這期間，將細(xì)胞移植到病灶周圍，興奮性毒性神經(jīng)遞質(zhì)、自由基、前炎癥介質(zhì)可能威脅移植的細(xì)胞。因此，移植時間的選擇必須考慮腦卒中恢復(fù)的自然過程，許多研究者延遲移植時間一直到功能缺損達(dá)到平臺期。然而，過分延長移植的等待時間，會導(dǎo)致瘢痕組織的形成，而這又不利于移植。Eriksson等 ]認(rèn)為腦損傷當(dāng)時的微環(huán)境不利于移植細(xì)胞的存活，可能是低氧等不利因素所致。同時，這種微環(huán)境隨著時間的延長而逐漸改善。也有人認(rèn)為缺氧、缺血損傷期間或損傷后盡早進(jìn)行干細(xì)胞移植有效，而對缺血性腦卒中后神經(jīng)干細(xì)胞移植的研究卻發(fā)現(xiàn)移植與損傷間隔7 d左右時移植細(xì)胞存活率最高，可能與此時的神經(jīng)毒性物質(zhì)減少，神經(jīng)營養(yǎng)因子釋放和血管發(fā)生有關(guān)[6]。我們認(rèn)為，卒中3 d后移植較合適。本C組NSS評分最低。
影響神經(jīng)干細(xì)胞移植療效的具體機(jī)制目前尚未明確，考慮可能與多因素(除移植時間外還可能與移植位點 、移植細(xì)胞量 。 等)有關(guān)。在本實驗中，我們在不同時間采用立體定向移植到大鼠的腦缺血區(qū)域，并且移植后對大鼠的功能恢復(fù)進(jìn)行評價，免疫組織化學(xué)方法染色檢查存活的細(xì)胞。顯示了神經(jīng)干細(xì)胞具有減輕缺血后神經(jīng)功能損害的作用，并且我們認(rèn)為在早期移植具有最佳的效果。首先，B、C、D組NSS評分明顯低于A 組，說明神經(jīng)干細(xì)胞在宿主腦內(nèi)遷移和分化；其次，C組的NSS評分低于B、D組，說明腦損傷后早期的微環(huán)境較利于移植細(xì)胞的存活。 |
